如何做好Stable transfection。G418抗生素的最佳篩選濃度。一般1g的粉劑中有效的G418抗生素含量大約為0.722g。

Stable Transfection

Stable Transfection (例如使用G418篩選)

篩選之前請先確定G418抗生素濃度：

1. 由於每種細胞對G418抗生素的敏感性不同，而且不同的廠家生產的G418有效成分的比重不同，一般1g 的粉劑中有效的G418抗生素含量大約為0.722g 。

2. G418抗生素是Neomycin的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成而殺死細胞的。但是Neomycin對真核細胞無作用而G418抗生素對細菌和真核細胞都起作用。在進行轉染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產生較大影響，加上G418抗生素有殺菌作用，所以有人主張轉轉染時不加其它抗生素。

3. 細胞密度(滿盤率)對G418抗生素篩選結果的影響很大，一般篩選時細胞密度(滿盤率)不宜超過50%

4. G418抗生素的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418抗生素的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度範圍內進行篩選，選擇在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418抗生素濃度調控來進行下一步的篩選試驗。

加藥時間和維持濃度：

1. 由於基因轉染到細胞內之後要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外來基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外來基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性，一般要在轉染24小時之後才開始加G418抗生素篩選。隨著細胞的代謝G418抗生素的濃度和活性都會下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418抗生素的篩選液。篩選時G418抗生素濃度可以調控高中低三種進行篩選。

2. 加G418抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因模組的抗性基因是否已經得到表達。一般是轉染24小時後加入G418抗生素。

3. 在挑出單一細胞克隆株後就可以用固定G418抗生素濃度，一般是篩選時濃度的1/2。
( 關於固定維持G418抗生素濃度，有人說細胞會出現對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的的話，可以調整G418抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達的單一細胞克隆株，想表達的基因不一定就會跟著高表達。)

篩選時的培養液：

加G418抗生素篩選約6天左右，細胞會大量死亡，培養盤中剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：

1. 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有G418抗生素表達的陽性細胞死亡，非選擇性死亡，因此要及時換液。

2. 培養盤中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：例如你要轉染3T3細胞，先在3T3細胞密度(滿盤率)達到80%的時候，在換液時將培養過的舊培養液收集，使用過濾器無菌處理，和新鮮的培養液按1：1混合備用。在轉染後加G418抗生素篩選過程中就可以使用這種培養基。

3. 適當增加血清濃度(如15%)。

篩選時出現的問題及其解決辦法：

問題1：使用HeLa Cell篩選時，現在已經篩選3週，在6孔盤中已經長出一些細胞簇，想把它挑到96孔盤中，使用2ul胰蛋白酶消化，在消化過程中，胰蛋白酶擴散，使細胞散開和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇彼此距離的很近），造成幾個細胞簇被胰蛋白酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎麼辦？
a、可以減少胰蛋白酶使用量；且胰蛋白酶在加入之前要用37℃ 恆溫箱中預熱，並且使用PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；或是改使用(ACCUTASE)。
b、加入胰蛋白酶後，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸乾淨，然後放到37℃ 恆溫箱中繼續作用1分鐘，這時，胰蛋白酶消化細胞可以繼續作用的，又可避免胰蛋白酶擴散。
c、顯微鏡下觀察細胞完全鬆散開，就可以在你感興趣的局部加培養基，並吸走你的可隆了呀
d、具體消化的時間需注意，如果在步驟b中顯微鏡下見細胞尚未完全鬆散開，可以再重複的，直到鬆散開，能夠被吸走為止。
e、或在100mm dish中挑克隆，細胞分的稀一點。
f、也可把細胞全部消化下來，在96孔盤中逐步稀釋獲得單一細胞。

問題2：篩選成功的機率；只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。能挑到穩定表達的機率一般認為大約有70~80％，但是想挑到表達量高且能穩定表達的，並不容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點太少的緣故。
問題3：單一陽性細胞克隆化的時機和個數：加抗生素篩選時，一般會等到確認已轉染細胞達到70%以上時,再做有限稀釋法，使克隆出陽性細胞，同時要保持適當的抗生素濃度，並注意突變和污染。若細胞生長(滿盤率)如有40%以上，就可以做有限稀釋了，一般篩選5，6個克隆是有需要的，但保險起見，多篩幾個吧。從單一陽性細胞克隆化時開始，就要增加對細胞營養及血清含量和生長因子。

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